Laboratórna diagnostika COVID-19

V súčasnosti sa pre diagnostiku infekcie vírusom SARS-CoV-2 v rutinnej praxi používajú dva typy laboratórnych vyšetrení – priame stanovenie nukleovej kyseliny a nepriama diagnostika založená na detekcii špecifických protilátok. Nasledujúca časť je venovaná použitiu týchto vyšetrení pre účely stanovenia diagnózy COVID-19.

Stanovenie nukleovej kyseliny RNA SARS-CoV-2

Analytická metóda

RT-PCR je polymerázová reťazová reakcia s reverznou transkripciou, pri ktorej sa RNA prepisuje do komplementárnej DNA (cDNA) prostredníctvom reverznej transkriptázy s následnou amplifikáciou cDNA. Diagnostika je zameraná na detekciu kombinácie génov v závislosti od výrobcu detekčnej súpravy. Medzi najčastejšie používané gény patria štrukturálne gény E a N, RdRp gén kódujúci RNA dependentnú RNA polymerázu  a otvorené čítacie rámce ORF1a a ORF1b.

Pokyny pre odber

Pre vyšetrenie sa využíva výter z nosohltana a dutiny ústnej [1,2], spútum, prípadne materiál z bronchoalveolárnej laváže, alebo endotracheálny aspirát. Je nutné použiť špeciálne plastové výterovky s jemnou kefkou zo syntetického materiálu (dacron, nylon, polyester apod.) Výterovka NESMIE obsahovať drevo a vatu, ktoré inhibujú PCR reakciu [2]. Výterovky sa umiestňujú do tekutého transportného média pre vírusy.

New England Journal Of Medicine zverejnil skvelý inštruktážny článok o správnej metodike nazofaryngeálneho výteru aj s názornou ukážkou (článok aj video sú v angličtine): https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMvcm2010260?query=RP

Výpovedná hodnota vyšetrenia

• RNA SARS-CoV-2 bola zistená u pacientov 1 až 3 dni pred nástupom príznakov a maximálna vírusová záťaž bola vo vzorkách z horných dýchacích ciest počas prvého týždňa infekcie, po čom nasledoval postupný pokles.  V stolici a dolných dýchacích cestách je vírusová záťaž najvyššia v druhom týždni choroby. U pacientov s ťažkým priebehom je doba pozitívnej detekcie vírusu z biologického materiálu z dýchacích ciest predĺžená.
• Vyšetrenie je určené pre diagnostiku skorej fázy ochorenia- 1.-8. deň od nástupu príznakov [2-7].
• Táto diagnostika má však výraznú limitáciu vo vyšetrovanom materiáli, resp. spôsobe jeho odberu a pre odbery z horných dýchacích ciest dosahuje maximálnu senzitivitu 70-75 % (u 25-30 % pacientov s COVID-19 je vyšetrenie falošne negatívne) [2,6,7].
• Podľa štúdie [15] zameranej na sledovanie pravdepodobnosti falošne negatívneho výsledku u pacientov po expozícii, ktorí boli neskôr potvrdení ako pozitívni sa pravdepodobnosť falošne negatívneho výsledku u infikovanej osoby zníži zo 100 % v 1. deň po expozícii na 67 % v deň 4. V priemere je 5. deň považovaný za deň nástupu symptómov. V tento deň bola stredná hodnota falošne negatívnych výsledkov 38% a ďalej sa znižovala až na 20% v deň 8. (3 dni po nástupe príznakov). Následne sa začala znova zvyšovať, čo však súvisí aj s „klírens“ infekcie.
• Podľa niektorých autorov je senzitivita ešte nižšia - Wang uvádza pre orofaryngeálny výter senzitivitu pre záchyt COVID-19 len 32 %, pre nasofaryngeálny 63 % [1]. Naviac senzitivita RT-PCR prudko klesá s časom trvania infekcie (12. deň od príznakov je na úrovni 30-40 %). Naopak, diagnostická senzitivita protilátok Anti-SARS-CoV-2 v čase stúpa (Graf 1) [6,7].
• Informáciu o infekčnosti pacienta poskytuje tzv. Ct (cycle treshold) hodnota, ktorú uvádzame na výsledkovom liste. Viac o jej interpretácii uvádzame v metodickom liste.

Graf 1: Zmena diagnostickej senzitivity (SE) laboratórnych vyšetrení COVID-19 v čase

Stanovenie protilátok tried IgG a IgM proti SARS-CoV-2

Analytická metóda

Imunoanalýza, najčastejšie ELISA, alebo chemiluminiscenčná imunoanalýza. Je nutné striktne rozlišovať medzi v súčasnosti rapídne pribúdajúcimi tzv. „rýchlotestami“ a certifikovanými, validovanými (CE IVD) laboratórnymi súpravami, kde sa dá predpokladať výrazne vyššia analytická kvalita. Pre orientáciu v tejto problematike je možné použiť stránku https://www.finddx.org/covid-19/sarscov2-eval-immuno/, kde tvorcovia budú postupne pridávať výsledky nezávislého hodnotenia kvality jednotlivých testov.

Ako antigén sa v ELISA a CLIA testoch používa S proteín alebo N proteín, dokazujú sa protilátky tried IgM, IgA a IgG. Dynamika protilátkovej odpovede detekovaná rôznymi diagnostickými súpravami sa môže výrazne líšiť. Hlavným dôvodom je rozdielny cieľ diagnostických protilátok - S, alebo N proteín.

Pokyny pre odber

Štandardný odber venóznej krvi pre získanie séra - skúmavka bez aditíva (VACUETTE s červeným viečkom)

Výpovedná hodnota protilátok IgM

• Začínajú sa tvoriť 1-2 týždne od kontaktu s infekciou, pozitívne sú od 5. dňa od nástupu príznakov. Od 8. dňa je ich diagnostická senzitivita na úrovni RT-PCR a ďalej stúpa až k maximu 85-90 % (Graf 1). Pozitivita IgM protilátok výrazne klesá po 3. týždni od symptomatológie, výnimočne môže však pretrvávať 2-4 mesiace.
• Doporučené postupy zatiaľ stanovenie Anti-SARS-Cov-2 IgM uvádzajú len ako doplnkové vyšetrenie k RT-PCR pre diagnostiku COVID-19 u asymptomatických osôb a osôb s miernymi príznakmi [2,3].
• Podľa recentných štúdií [6,7] je však možné IgM protilátky využiť aj k diagnostike, ich senzitivita je od 8. dňa od vzniku symptomatológie dokonca vyššia než senzitivita RT-PCR (Graf 1 a Tabuľka 1).

Tabuľka 1: Zmena diagnostickej senzitivity laboratórnych vyšetrení COVID-19 v čase

Výpovedná hodnota protilátok IgG

• Začínajú sa tvoriť 2.-4. týždeň od nástupu príznakov, pozitivita pretrváva niekoľko mesiacov. U imunokompetentných pacientov je nástup sérokonverzie rýchlejší ako u imunokompromitovaných.
• Ich vyšetrenie je vhodné predovšetkým k vyhľadávaniu osôb s prekonaným ochorením, alebo asymptomatickým priebehom ako súčasť epidemiologických prehľadov (napr. pre odhad šírenia pandémie, identifikáciu ohnísk nákazy, po ukončení karantény apod.).
• Koncentrácie IgG proti N antigénu boli naopak signifikantnejšie vyššie u pacientov na JIS, kontinuálny vzostup protilátok indikoval progresiu ochorenia.
• Zvýšenie IgG proti S antigénu je asociované s miernejším priebehom ochorenia (nízke CRP, bez nutnosti UPV), tento typ protilátok vykazuje signifikantne vyššie hodnoty u pacientov s miernejším priebehom ako u pacientov na JIS. Známa je tiež korelácia medzi zníženou infekčnosťou, znížením vírusovej záťaže a nárastom koncentrácie protilátok proti S-antigénu. Uvedené dáta sú v súlade s neutralizačným charakterom protilátok.

Závery pre prax

• Priamy dôkaz vírusu RT-PCR RNA je spolu s klinickými príznakmi a pozitívnou epidemiologickou anamnézou metódou voľby pre diagnostiku COVID-19 skorej fáze ochorenia (1-4 dni od začiatku symptómov) a pre posúdenie infekčnosti pacienta. Senzitivita tejto metódy veľmi závisí na mieste odberu (materiál z DDC je vhodnejší než z HDC) a kvalite odberového materiálu (drevo a vata sú známe inhibítory PCR reakcie).
• V súčasnosti je vyšetrenie Anti-SARS-CoV-2 doporučené pre epidemiologickú surveillance - identifikovanie jedincov s prekonaným ochorením, alebo miernym/asymptomatickým priebehom [2-5, 8].
• Z výsledkov posledných štúdií je zrejmé, že každá z metód poskytuje inú, ale v prípade oboch metód diagnosticky cennú informáciu (Tabuľka 1) a vyšetrenie Anti-SARS-CoV-2 IgM má svoje miesto v diagnostike pozdejšej fázy COVID-19 (po 4. dni od začiatku symptómov). Pri voľbe metódy nutné zohľadniť zmeny jej senzitivity v priebehu trvania infekcie (Graf 1 a Schéma 1).
•  Z hľadiska analytickej kvality by sa malo preferovať stanovenie protilátok CE-IVD certifikovanou a validovanou laboratórnou metódou (ak je dostupné). Pri interpretácii výsledkov je nutné brať ohľad na použitý diagnostický kit (rozdielna dynamika a prognostická hodnota Anti-S-IgG a Anti-N-IgG).
• Najvyššiu diagnostickú výťažnosť v ktoromkoľvek časovom okamihu je možné dosiahnuť pri multimarkerovej stratégii, t.j. kombináciou oboch testov, prípadne sekvenčným testovaním (Schéma 1).
• Izolované vyšetrovanie RT-PCR RNA u asymptomatických jedincov s negatívnou epidemiologickou anamnézou je veľmi sporné (výsledok odráža len situáciu v momente odberu, nie je možné zistiť fázu ochorenia - riziko vysokej falošnej negativity).

Schéma 1 : Indikácia testov pre diagnostiku COVID-19 s ohľadom na ich diagnostickú senzitivitu.

Možnosti diagnostiky COVID-19 v SK-Lab (stav k 11.12.2020)

Vyšetrenie protilátok Anti-SARS-CoV-2

• Pre stanovenie protilátok využívame CE-IVD validovanú metódu na princípe chemiluminiscenčnej imunoanalýzy. Odber indikuje a vykonáva ošetrujúci lekár, používa sa štandardná sérová skúmavka (VACUETTE, červené viečko). Vyšetrenie je hradené zdravotnými poisťovňami.
• Postup pre objedanie vyšetrenia  je uvedený tu.

Vyšetrenie RT-PCR RNA vírusu SARS-CoV-2

• Od 7.5.2020 je v prevádzke odberové miesto SK-Lab pre výtery z nazofaryngu a orofaryngu. 10.8.2020 sme spustili prevádzku laboratória pre analýzu extrahumánneho genómu, kde následne prebieha izolácia a detekcia nukleovej kyseliny vírusu SARS-CoV-2 metódou RT-PCR.
• Postup pre objedanie vyšetrenia a odberu na odberovom mieste SK-Lab  je uvedený tu.

Ďalšie vyšetrenia

• Laboratórny obraz pacienta s miernym/asymptomatickým priebehom COVID-19 sa v základných biochemických a hematologických parametroch podobá iným vírusovým infekciám (lymfocytóza, mierne zvýšenie CRP)
• Nepriaznivý priebeh COVID-19 je spojený s neutrofíliou, zvýšeným IL-6, PCT a CRP (signalizujú bakteriálnu superinfekciu, poškodenie pľúcneho parenchýmu), lymfopéniou (nízka reakcia imunitného sytému na vírus), zvýšením ALT, AST, bilirubínu (hepatopatia), zvýšením kreatinínu (nefropatia), trombocytopéniou, pozitívnymi D-dimérmi, predĺženým protrombínovým časom (počínajúca DIC), zvýšeným troponínom (poškodenie srdcového svalu). Tieto vyšetrenia je vhodné opakovať predovšetkým u hospitalizovaných pacientov s odstupom 2-3 dní, alebo ihneď pri zmene klinického stavu [4].
• V rámci posúdenia prognózy u pacientov s COVID-19 a monitoringu ich stavu je vhodná aj indikácia vyšetrení zameraných na bunkovú imunitu (B-Krvný obraz + dif., B-FlowCyto Panel 1, Skúmavka s EDTA – VACUETTE fialové viečko) a humorálnu imunitu (S-IgG, S-IgM, S-IgG, skúmavka pre sérum – VACUETTE červené viečko). Vyšetrenia je vhodné indikovať u suspektného pacienta spolu s RT-PCR RNA, alebo Anti-SARS-CoV-2 a v prípade potvrdenia COVID-19 následne opakovať s týždenným odstupom pre posúdenie dynamiky [9].

V prípade akýchkoľvek otázok sme k dispozícii na tel. 047/4333210, 211, a peter.secnik@sklab.sk, peter.secnikjr@sklab.sk.

Vypracovali: MUDr. Peter Sečník ml. (lekár SK-Lab), MUDr. Lenka Helmová (odborný zástupca SK-Lab pre klinickú mikrobiológiu)

Zdroje:

1. Wang W, Xu Y, Gao R, Lu R, Han K, Wu G, et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 2020.
2. Dřevínek P., Macková B., Hubáček P.: Odborné stanovisko Společnosti pro lékařskou mikrobiologii České lékařské společnosti J.E. Purkyně k mikrobiologické diagnostice COVID-19. 25.3.2020
3. Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Persons for Coronavirus Disease 2019 - https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/guidelines-clinical-specimens.html, date of access: 7.4.2020
4. IFCC Information Guide on COVID-19 (https://www.ifcc.org/ifcc-news/2020-03-26-ifcc-information-guide-on-covid-19/), date of access: 7.4.2020
5. WHO interim guidance for laboratory testing (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance), date of access: 7.4.2020
6. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. Clin Infect Dis. 2020.
7. To KK, Tsang OT, Leung WS, Tam AR, Wu TC, Lung DC, et al. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. Lancet Infect Dis. 2020.
8. Loeffelholz MJ, Tang YW. Laboratory diagnosis of emerging human coronavirus infections - the state of the art. Emerg Microbes Infect. 2020;9(1):747-56.
9. Liu J, Li S, Liu J, Liang B, Wang X, Wang H et al. Longitudinal Characteristics of Lymphocyte Responses and Cytokine Profiles in the Peripheral Blood of SARS-CoV-2 Infected Patients (2/16/2020). Available at SSRN: https://ssrn.com/abstract=3539682 or http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.3539682
10. Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 and Other Human Coronaviruses, Shibo Jiang,Christopher Hillyer,Lanying Du, dostupné na https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7098029/
11. Evaluation of Nucleocapsid and Spike Protein-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for Detecting Antibodies against SARS-CoV-2, Wanbing Liu, Lei Liu, Guomei Kou, Yaqiong Zheng, Yinjuan Ding, Wenxu Ni, Qiongshu Wang, Li Tan, Wanlei Wu, Shi Tang, Zhou Xiong, Shangen Zheng, dostupné na https://jcm.asm.org/content/58/6/e00461-20
12. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19, Quan-Xin Long, Bai-Zhong Liu, Ai-Long Huang, Nature Medicine volume 26, pages845–848, dostupné na https://www.nature.com/articles/s41591-020-0897-1
13. Kinetics of SARS-CoV-2 specific IgM and IgG responses in COVID-19 patients, Baoqing Sun,Ying Feng,Xiaoneng Mo,Peiyan Zheng,Qian Wang,Pingchao Li, dostupné na https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/22221751.2020.1762515
14. Štandardný postup pre mikrobiologickú diagnostiku pri suspektnej infekcii vírusom SARSCoV2 pre laboratóriá klinickej mikrobiológie. MUDr. Monika Czirfuszová, PhD. a kol
15. Lauren M. Kucirka, MD, PhD, Stephen A. Lauer, PhD, Oliver Laeyendecker, PhD, MBA, Denali Boon, PhD, and Justin Lessler, PhD,. Variation in False-Negative Rate of Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction–Based SARS-CoV-2 Tests by Time Since Exposure, Ann Intern Med. 2020 May 13 : M20-1495. Dostupné na:

Skratky:

• Anti-SARS-CoV-2 – vyšetrenie protilátok proti vírusu spôsobujúcemu ochorenie COVID-19.
• RT PCR RNA – vyšetrenie prítomnosti nukleovej kyseliny vírusu spôsobujúceho ochorenie COVID-19 metódou real-time polymerase chain reaction.
• ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay
• WHO – World Health Organisation
• CDC – Centers for Disease Control and Prevention
• IFCC - International Federation for Clinical Chemistry
• EUCDC – European Center for Disease Control and Prevention
• SZÚ ČR – Státní zdravotní ústav České republiky
• DIC – diseminovaná intravaskulárna koagulácia
• HDC – horné dýchacie cesty
• DDC – dolné dýchacie cesty